Rickettsia Slovaca en Catalunya
1 INTRODUCCION
1.1 Generalidades: Rickettsias
El nombre de Rickettsias se debe al Dr. H. T. Ricketts quien murió víctima del tifus en 1916 cuando estudiaba la enfermedad (Weiss et al 1984). Las bacterias de este género son responsables de enfermedades de importancia zoonótica distribuidas en el mundo; tal es el caso de las fiebres manchadas de las montañas rocosas, la fiebre botónosa del mediterráneo, el tifus entre otras. Estos microorganismos presentan ciclos biológicos complicados. La infección clínica por Rickettsias spp. en humanos inicialmente presenta síntomas sistémicos poco específicos, como fiebre, dolor de cabeza, mialgia, tumefacción ganglionar y malestar general, lo que hace difícil cualquier diagnóstico temprano basado en la semiología clínica. Signos adicionales como el exantema y la formación de escaras pueden clarificar la distinción de estas patologías, pero pueden no ser definitivos (McDade JE, Fishbein DB). Algunas complicaciones pueden involucrar a distintos órganos, incluyendo al sistema nervioso. En la década de los 70 se relacionó la presencia de una cepa de Rickettsia con un caso de meningoencefalitis (Walker DH, et al 1997). Los cuadros febriles en humanos a menudo suelen ser autolimitados, pero en ocasiones pueden presentar secuelas a largo plazo e incluso ser fatales si no son tratados a tiempo (Weiss E , etal 1984).1.2 Microbiología
Las Rickettsiosis son patologías causadas por microorganismos pequeños, el tamaño del genoma rickettsial es de 1-1,6 Mb y consiste en un único cromosoma circular. Estos microorganismos eran considerados intermedios entre los virus y las bacterias, lo cual llevó a grandes controversias en su clasificación. Finalmente, parece que la comunidad científica está de acuerdo en que se acercan más a las bacterias, no sólo por su morfología si no por su fisiología (Walker DH, Dumler JS 1997). Las Rickettsia se parecen a los virus en la necesidad de células vivas para poder propagarse, son pues parásitos intracelulares obligados a pesar de contener ADN y ARN en relación 3,5:1 que es similar al cociente señalado para muchas bacterias. Sus paredes celulares contienen ácido murámico y en su interior se ha encontrado ácido diaminopimélico. En general las paredes son similares a las que se observan en las bacterias gram negativas y muestran actividad endotóxica, siendo sensibles a los antibióticos (Weiss E. , Moulder J.W 1984). Estos pequeños bacilos de (0,3 a 1,0 mm) residen libremente en el citoplasma de las células endoteliales humanas y en diversas células de sus huéspedes artrópodos; se multiplican por fisión binaria en forma muy similar a como lo hacen las bacterias, en cultivo celular algunos estudios revelan que el tiempo de generación es de 8 a 10 horas a 34°C. Las Rickettsias presentan una reacción de tinción gramnegativa, excepto Coxiella burnetii causante de la fiebre Q. La tinción de Gram es poco sensible a la demostración de Rickettsias intracelulares (Walker DH, Dumler JS 1997). La coloración de las Rickettsias no es fácil de conseguir con los métodos habituales y requiere la aplicación de algunos métodos de tinción como el Giemsa y la coloración de Giménez. Las Rickettsias se tiñen de un color púrpura rojizo y de un rojo brillante al utilizar la técnica de Giménez, aún así este tipo de técnicas presentan algunos inconvenientes que dificultan un diagnóstico certero. También vale la pena mencionar que las Rickettsias son difíciles de demostrar en tejidos fijados mediante estas tinciones. (Walker DH, Dumler JS 1997). Antigénicamente, el género Rickettsia está constituido por bacterias gram negativas que pertenecen a la familia Rickettsiaceae y forman dos grupos bien definidos: el grupo de las fiebres manchadas (SFG) y el grupo del tifus (TG). Todas las especies del género tienen en común la necesidad de ser parásitos intracelulares, su corta vida fuera de los vectores y las dificultades propias de cultivos en laboratorio, también que su ciclo vital salvaje se mantiene al infectar distintas especies de artrópodos (vectores) tales como pulgas, piojos y garrapatas y hospedadores básicamente mamíferos incluyendo a la especie humana aunque ésta constituye sólo un huésped accidental. A pesar de ello, este tipo de enfermedades presentan un alto impacto a nivel mundial debido a la gran prevalecía y la gran morbilidad en numerosas áreas (Azad AF, Radulovic 2003) . El presente trabajo se centra en una especie nueva de rickettsia perteneciente al grupo de las fiebres manchadas (SFG) trasmitida por la picadura de garrapata que fue descrita por el Dr. Lakos en Hungría en 1997 (Lakos A, 1997). Esta rickettsiosis esta producida por la Rickettsia slovaca, esta fue aislada por primera vez en 1968 y fue llamada slovaca al ser encontrada en la República de Eslovaquia en una garrapata de la especie Dermacentor marginatus. Sin embargo solo fue hasta 1997 cuando se notificó el primer caso clínico probado en humanos asociado a la presencia de esta Rickettsia, lo cual despertó el interés científico y dejó al descubierto la necesidad de una mejor identificación del agente causal de las rickettsiosis (Raoult D, Berbis P. et al 1997). La enfermedad producida por esta Rickettsia es conocida con el nombre de Tíbola y se caracteriza por una marcada tumefacción ganglionar (lifoadenopatia transmitida por garrapatas) y cuadros febriles acompañado de la presencia de una escara necrótica generalmente ubicada en el cuero cabelludo. El contagio en humanos se produce al estar en contacto con la naturaleza ya que el vector Dermacentor Marginatus, parásita diferentes animales tales como cabras, ovejas y jabalís, en este último es común hallar este tipo de garrapata. El jabalí es un mamífero que está ampliamente distribuido en la geografía catalana y como hace parte de la cultura de la caza, constituye un puente ideal para el contacto entre el vector y los humanos. En las épocas de otoño e invierno es donde se reportan la mayoría de los casos clínicos, concordando con los hábitos propios del vector. El mayor número de casos está reportado en Hungría, pero también hay notificaciones en Francia y en España, donde se ha presentado un número importante de casos en los últimos años en regiones como La Rioja y Cataluña. (Oteo Ja, et al 2003) . Las Rickettsias en general siguen constituyendo un claro problema sanitario que parece recobrar importancia con el paso del tiempo. Con el desarrollo de técnicas de biología molecular (PCR - RFLP) que permiten una identificación segura y rápida de este tipo de microorganismos, se hace cada vez más imprescindible la identificación de los diferentes tipos de Rickettsias que potencialmente pueden causar enfermedad en zonas donde este tipo de zoonosis tiene cierta relevancia como lo es el área mediterránea y en este caso Cataluña. El estado de este tipo de infecciones, denominadas infecciones emergentes, depende del estado del conocimiento de las especies de Rickettsias que se hallan en dicha zona y para ello es importante conocer y diferenciar las cepas presentes en esta área, ya que de esto depende un buen diagnóstico y una adecuada prevención.1.3 Vectores.
1.3.1 Familia Ixodidae
Son garrapatas de escudo duro o rígido, en el caso del macho se extiende por toda la superficie dorsal, pero en la larva, en la ninfa y en la hembra, sólo ocupa una pequeña parte detrás de la cabeza. La familia Ixodidae reúne a casi 700 especies (Barriga, 1994) distribuidas en trece géneros a saber: Amblyoma, Anomalohimalaya, Aponomma, Boophilus, Cosmiomma, Dermacentor, Haemaphysalis, Hyalomma, Ixodes, Margaropus, Nosamma, Rhipicentor y Rhiphicephalus (Hoogstraal & Aeschilmann, 1982).1.3.2 Dermacentor Marginatus
Es una garrapata que tiene como hospedador habitual a ovejas, cabras, perros y ganado vacuno. También se encuentra en caballos, lobos, jabalís, en la vegetación y en micro mamíferos (Rehacek, 1993). La hembra es capaz de colocar hasta 4.000 huevos, que eclosionan del 14 a los 21 días. La larva se alimenta en 2 ó más días (Soulby, 1988). Es vector de la fiebre hemorrágica de Crimen-Congo, del TIBOLA (tick-borne lymphadenopathy), el cual se considera el agente etiológico trasmisor de la Rickettsia slovaca (Raoult et al 1997), como también lo es de la rickettsiosis asiática R. tsutsugamushi (Acha & Szyfres, 1986). El adulto parásita mustélidos, lagomorfos, caninos, suinos, ovinos, caprinos, equinos y humanos entre otras especies (Estrada & Peña , 1992), mientras que las larvas y las ninfas parasitan especialmente a roedores y comadrejas (Gliot Pautou, 1983). La localización más común es la cabeza y el cuello de sus hospedadores (Gliot et al , 1993). Las formas adultas pueden estar activas prácticamente todo el año, pero en la península Ibérica se ha observado que presentan mayor actividad durante los meses de Octubre a Marzo, siendo variable de acuerdo a las zonas climáticas y a los factores ambientales de la zona (Rehacek J., 1993).Distribución en Europa, España y Cataluña
La distribución de esta garrapata es amplia (Sulzer, 1976), ya que puede encontrarse en Alemania (Borchert , 1975), Albania, Austria, Bulgaria, en la ex Checoslovaquia, España, Hungría, Italia, Portugal, Rumanía, Líbano, Suiza, Rusia, Irán, Marruecos, Turquía (Estrada & Peña , 1992), Polonia (Suida , 1995), Francia (Gilot et al , 1995), Argelia, Túnez, Islas Canarias y Afganistán (Soulsby 1988). Su hábitat es de tipo estepario, de áreas semidesérticas y de montaña, siendo fácil de encontrar en zonas donde la vegetación es de tipo arbustivo hasta unos 2500 m sobre el nivel del mar. Se puede hallar en casi toda la península Ibérica dentro de un rango de pluviosidad de 200 a 1.000 mm anuales. 2. HIPÓTESIS Teniendo en cuenta que la Rickettsia Slovaca está presente en muchos países de Europa, y conociendo que es transmitida por Dermacentor Marginatus, una garrapata frecuentemente hallada en el jabalí (sus scrofa), también muy presente en la península Ibérica, se espera que:
- Los jabalís presentes en Cataluña estén infectados con Dermacentor Marginatus.
- Que las garrapatas Dermacentor Marginatus encontradas en jabalís estén infectadas con Rickettsia Slovaca.
3 OBJETIVOS
Conocer la prevalencia (o incidencia?) de Rickettsia spp. que infectan a las garrapatas aisladas de jabalí en Cataluña. Mediante el uso de técnicas moleculares (PCR) Conocer la prevalencia (o incidencia?) de Rickettsia Slovaca. que infectan a las garrapatas aisladas de jabalí en Cataluña. Utilizando técnicas de (Rflp) para la identificación de la ricketsia en cuestión.4 MATERIAL Y MÉTODOS
Durante el periodo de febrero a abril del 2004 se realizó la recolección de garrapatas directamente del jabalí, en coordinación con asociaciones de cazadores en la zona del Vallés Occidental.4.1 Identificación y clasificación de las garrapatas
Las garrapatas fueron llevadas al laboratorio, vivas, donde fueron clasificadas por la Dra. Anna Ortuño de la Universidad Autónoma de Barcelona según la especie, utilizando el método de visualización directa y siguiendo claves taxonómicas. Fueron reconocidas un total de 45 garrapatas adultos de la especie Dermacentor Marginatus , las cuales fueron congeladas a -80ºC hasta su utilización en la búsqueda de Rickettsia spp. mediante técnicas moleculares de (PCR), y la posterior identificación de especies rickettsiales por (RFLP).4.2 Técnicas de identificación de Rickettsias por PCR
Para la determinación de la presencia de Rickettsias sp., se utilizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para ello se extrajo el ADN de la garrapata.4.2.1 Extracción de DNA:
El ADN para la amplificación por PCR de fragmentos genómicos específicos de Rickettsia sp. fue obtenido a partir de garrapatas utilizando QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH) que básicamente consta de los siguientes pasos. Las muestras sumergidas en 180 µl de tampón ATL y en 20 µl de Proteinasa K se incubaron 56°C durante 12 horas aproximadamente para provocar la lisis de las estructuras proteínicas de la muestra. La acción enzimática se frenó con 200 µl de tampón AL y una incubación de 10 min a 70ºC. El ADN se recuperó en 200 µl de etanol que se añadieron antes de pasar toda la muestra por la columna donde quedó adherido a la matrix de la misma. Luego de dos lavados sucesivos con solución tampón AW1 y AW2, se eluyó el ADN en solución AE. Se determinó la pureza del ADN por espectrofotometría midiendo la absorbancia a 260 nm - correspondiente a ácidos nucleicos - y a 280 nm - correspondiente a proteínas -. El cociente entre ambos valores corresponde a la pureza del ADN total extraído. Un valor óptimo de pureza oscila entre 1.5 y 2. El ADN es estable a 4ºC durante más de 1 año. En este caso, se dejaron algunas alícuotas a 4ºC para evitar continuas congelaciones y descongelaciones que afectarían su estabilidad, y otra alícuotas sí se congelaron a - 80ºC para su conservación durante un tiempo más prolongado.4.2.2 PCR:
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método mediante el cual se amplifican múltiples copias de un fragmento de ADN específico, lo cual resulta útil en la búsqueda de microorganismos aunque se encuentren en bajas concentraciones. Para ello una enzima, la ADN polimerasa, sintetiza un fragmento complementario al ADN y correspondiente al gen que se quiere amplificar. La enzima requiere de cloruro de magnesio como co-factor y de nucleótidos como bases de fuentes nitrogenadas necesarias en la extractura de ADN. La enzima, la sal, y los dinucleótidos están inmersos en una solución tampón específica que contribuye en la amplificación del fragmento de ADN. Para la detección de infecciones por Rickettsias sp. en garrapatas se amplificó un fragmento del gen de la citrato sintasa de 381 pb, utilizando como primers RpCS 877p y RpCS 1258n secuenciados del gen de R. prowazekii. En un volumen final de 50ml, se mezcló 5ml de tampón 10X, 0.02 ml de MgCl2 (25 mM), 1 ml dNTP (200 mM), 1.25ml RpCs 877 (5 pmol), 1.25 ml RpCs1258 (5 pmol), taq DNA polimerasa 0,1 ml, DNA 2 ml y 39.38ml H2O. Para la estandarización de la técnica de PCR se siguió el protocolo realizado por Regnery y colaboradores publicado en el (Journal of Bacteriology. Mar. 1991. 173 (5) 1576-89). Como controles negativos se utilizó agua en lugar de ADN, así como ADN de E. coli, S.aureus, P. areuginosa y ADN extraido de sangre de tres neonatos. Como controles positivos se utilizó ADN de Bar29, de R. conorii, y de R. slovaca. La PCR se constituye de tres pasos fundamentales (desnaturalización, alineamiento, y extensión) que se repiten en un número limitado y suficiente de veces, para visualizar el producto amplificado en un gel de agarosa luego de una electroforesis horizontal. Durante la desnaturalización se separan las dos cadenas de ADN. Una vez que las hebras están separadas, se baja bruscamente la temperatura, lo cual permite el acople o alineamiento entre los cebadores específicos y el fragmento ADN complementario. Luego, a temperaturas más elevadas, sigue un proceso de extensión, donde la ADN polimerasa va incorporando nucleótidos a partir del cebador inicial. Este proceso se repite una y otra vez, durante un número determinado de ciclos. En este caso se optimizó la técnica hasta definir el tiempo y la temperatura adecuados en cada paso. 1) La desnaturalización se realizó a 95º C durante 20 segundos.2) La alineación se realizó a 48º C durante 20 segundos.3) La extensión se realizó a 48º C durante 20 segundos.
Este proceso se repitió durante 35 ciclos en termociclador GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystem)
Una vez obtenido ADN tanto de garrapatas, como de Rickettsia sp., se realizó la amplificación por PCR de tres fragmentos específicos del género Rickettsia sp. (Eremeva et al , 1994): 1) gen que codifica la citrato sintasa (gltA), 2) gen que codifica el antígeno de 190 KDa (ompA), 3) gen que codifica el antígeno de 120 KDa (omp B). La amplificación del ADN por PCR fue verificada por electroforesis horizontal rápida en geles de agarosa al 1.8% más bromuro de etidio con 8 ml del producto de PCR. Los amplificados fueron visualizados en un transiluminador UV.
4.2.3 Identificación de las cepas rickettsiales por RFLP:
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Las muestras positivas por PCR, fueron nuevamente amplificadas y digeridas con enzimas de restricción en una técnica que se llama RFLP (estudio del polimorfismo de los fragmentos de restricción) para poder determinar la especie de Rickettsia causante de infección en Dermacentor Marginatus. Para ello, una vez amplificados los fragmentos útiles para la identificación de rickettsias, se digirieron con las endonucleasas: RsaI, PstI, AluI. Estas digestiones generan un patrón de fragmentos que permite comparar unos patrones con otros mediante un sistema de análisis de geles y según el peso molecular de dichos fragmentos se determinar la especie o especies de Rickettsias presentes. Para ello se utilizaron alícuotas de 23,3 ml del producto amplificado se digirieron con 1 ml (10 a 20 U) de los diferentes enzimas de restricción. Los fragmentos amplificados correspondientes al gen de la citrato sintasa (gltA) se digirieron con la endonucleasa AluI, los del gen que codifica para la OmpA con RsaI y PstI y para la OmpB se utilizó la endonucleasa RsaI. Como en la PCR, los fragmentos de restricción obtenidos se hicieron migrar en geles de agarosa al 1,8% y mediante tinción con bromuro de etidio se observaron en transiluminador UV.
4.2.4 Análisis de los datos
Para el análisis estadístico de los resultados obtenidos se utilizó el programa estadístico Statgraphics versión 4.0, programa con el cual se realizaron las aplicaciones estadísticas y para el diseño de las gráficas fue utilizado el programa M.excell 2000. 5.RESULTADOS Para el análisis de los resultados de este estudio se realizaron comparaciones de porcentajes ya que es una prueba estadística no paramétrica que permite comparar y relacionar proporciones entre diferentes grupos experimentales, esta es una prueba comúnmente utilizada en clínica para estudios donde se ven involucrados la sensibilidad y la especificidad (Dawson et al 1990.)5.1Análisis por PCR
De las 45 garrapatas utilizadas en este estudio y analizadas por PCR, 22 (48.8%) fueron positivas, 9 (20%) fueron negativas y 14 (31.1%) fueron dudosas La PCR resultó claramente positiva en 17 (37.7%) de las 45 muestras analizadas. 10 (22.2%) fueron definitivamente negativas y un igual número de muestras resultaron dudosas. 13/15 (86%) animales presentaban por lo menos 1 garrapata infectada con Rickettsia sp. De 5 animales se extrajeron garrapatas negativas (33.3%) y en garrapatas de 7 animales (46.6%) se obtuvo un diagnóstico dudoso. Doce de los quince animales tenían al menos un vector infectado con Rickettsia sp. lo cual representa el 80% de los animales. 5 de los 15 animales presentaban por lo menos 1 vector negativo a Rickettsia sp. lo cual es un 33.3% y 9 de los 15 animales presentaban por lo menos una muestra de dudosa interpretación lo que representa que en un 60% de los animales se encontró por lo menos 1 muestra cuya interpretación no pudo ser clara.5.3Análisis RFLP
Se identificaron como Rickettsia Slovaca de acuerdo al RFLP, 8 muestras lo que representa un 17.7% del total de muestras. La distribución de Rickettsia Slovaca en los animales (jabalíes) muestreados muestra que en 6 de los 15 animales de donde fueron obtenidas las garrapatas se detectó por lo menos una muestra positiva a Rickettsia Slovaca lo que corresponde a un 40% del total de los animales estudiados. 6. Discusión En el presente estudio se refleja la importancia que tiene la Rickettsia Slovaca en nuestro medio desde el punto de vista infeccioso y como vector de la enfermedad al entrar en contacto con animales salvajes, en el caso de nuestro estudio con el jabalí (sus scrofa) que hace parte de el ciclo salvaje en el que cada vez mas se ve involucrado el Hombre como huésped accidental gracias en parte al gran crecimiento poblacional que ha experimentado el jabalí en nuestra zona (Rosell et al 1995) y a el cambio en las actividades de ocio y deporte en nuestra sociedad que hace que los biotipo propios para esta especie sean vulnerados por la presencia humana (Ortoño et al 2007). La Rickettsia Conororii había sido considerara durante mucho tiempo como la única Rickettsia trasmitida por picaduras de garrapatas en una basta zona de Europa, Francia central y norte de España (Raoult and Lakos et al 2002) la presencia de infección por Rickettsia Slovaca en garrapatas Dermacentor Marginatus y Dermacentor Reticulatus pone de manifiesto la patogenicidad de esta Rickettsia trasmisora del tibola ; cada vez son mas numerosos los estudios que mediante el uso de técnicas moleculares demuestran que en muchos casos de Rickettsiosis diagnosticadas en humanos el agente patógeno responsable corresponde a la Rickettsia Slovaca y actualmente representan ya un 19% de las Rickettsiosis diagnosticadas en Europa (Ortuño et al 2007), la temporalidad y frecuencia de presentación refuerzan esta teoría ya que normalmente en los mese fríos del año se presenta los casos de infección por esta Rickettsia (Rauolt and lakos et al 2002) coincidiendo esto con los hábitos de la garrapata Dermacentor Marginatus (Rehacek J., 1993), que es considerada actualmente como el principal vector portador de la Rickettsia Slovaca. El vector de esta linfoadenopatia (Tibola) es una garrapata llamada Dermacentor Marginatus que presenta una amplia distribución y una excelente adaptabilidad en el territorio Europeo, esta garrapata parasita una gran variedad de animales domésticos al igual que afecta la fauna en estado salvaje tal es el caso del jabalí (sus scrofa). Las garrapatas duras (Ixodidae) se han convertido en los principales vectores de enfermedades infecciosas en el mundo industrializado generando esto el paradigma de la enfermedades infecciosas emergentes (Oteo Revuelta 2002). Existen referencias sobre enfermedades trasmitidas por garrapatas desde la época del faraón Ramsés II (Exodo,9-3) y ya eran reconocidas como parásitos desde la antigua Grecia. Expuesto lo anterior parece evidente que estén dadas las condiciones en nuestra zona para el desarrollo del ciclo infeccioso. En primer lugar existe el tipo de garrapata (Dermacentor Marginatus) (Gilot et al 1993) considerada hasta ahora como el vector trasmisor mas importante de este tipo de linfoadenopatia (Oteo et al 2003). En segundo lugar tenemos garrapatas de esta especie infectadas por Rickettsia Slovaca (Ortuño et al 2006) y en tercer lugar tenemos como la victima susceptible, el hospedero accidental que es el humano. De acuerdo con los resultados obtenidos de este estudio se observa que las garrapatas extraídas de los jabalís son positivas a Ricketsia spp en un 48.8 % (pcr) y de las garrapatas positivas a Rickettsia spp el 17.7 % son positivas a Rickettsia Slovaca, estos datos se aproximan a los datos obtenidos en estudios anteriores como los de (Rauolt and Lacos) y los de (Ortuño et al) Estos porcentajes podrían ser mas elevados si se ampliará el numero de muestras o podría variar dependiendo de la zona donde se desarrolle la investigación en cualquier caso todo parece apuntar a que es factible que una gran población de garrapatas este infectada con Rickettsia Slovaca. Este hecho confirma la actividad infectiva o infectante de la Rickettsia Slovaca en nuestro medio y deja de manifiesto el potencial riesgo de infección para la población humana rural. 8. CONCLUCIONES:- Las técnicas moleculares de (PCR Rflp) son una herramienta interesante en el diagnostico de nuevas rickettsiosis.
- Es necesario realizar muestreos regulares y monitorizar el estado de estas infecciones emergentes en nuestro medio
- La infección de las garrapatas Dermacentor Marginatus con Rickettsia Slovaca crean la situación ideal para que se mantenga el ciclo salvaje y esto podría ser un riesgo potencial en la epidemiologia de la enfermedad en regiones como Catalunya.
- El crecimiento de la población del jabalí (Sus Scrofa) favorece el contacto y la diseminación del vector (Dermacentor marginatus)
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